La cryoconservation des cellules : pourquoi ? comment ?
La cryoconservation est une technique utilisée pour conserver les cellules de façon viable à ultra-basse température. Il s’agit donc d’une technique essentielle au sein d’un laboratoire de culture cellulaire, dont il convient de maîtriser chaque paramètre afin de garantir une qualité optimale des cellules après décongélation. L’objectif de ce blog est de faire le point sur les points critiques à prendre en compte lors de la cryoconservation de cellules.
Pourquoi cryoconserver ses cellules ?
Les objectifs sont multiples :
- Sécuriser l’approvisionnement en cellules primaires ou en lignées transformées, en assurant une réserve de secours (back-up) en cas de perte, notamment dans le cas d’une contamination microbiologique de la culture.
- Limiter les dérives génétiques qui peuvent avoir lieu au sein d’une lignée en permettant d’utiliser des cellules de passage précoce lorsque les cultures en cours ont été maintenues pendant une période prolongée
- Standardiser les lignées utilisées d’un laboratoire à l‘autre, par l’emploi de banques cellulaires primaires et secondaires
Une congélation mal maîtrisée altère les cellules
Les dommages cellulaires survenant durant la congélation peuvent être causés par divers phénomènes :
- Formation de glace : lors d’une congélation lente, l’eau s’échappe des cellules et de la glace se forme dans l’espace inter-cellulaire. Les cristaux de glace, constitués d’eau pure, repoussent alors les solutés, ce qui augmente leur concentration locale dans l’eau liquide restante et peut s’avérer toxique (‘’effet de solution’’).
- Déshydratation & écrasement : Cet ‘’effet de solution’’ s’accompagne d’une déshydratation importante de la cellule. Trop de glace entre les cellules peut aussi les écraser.
- Altération des membranes cellulaires : une congélation rapide entraîne généralement la cristallisation intracellulaire de la glace conduisant à la formation de cristaux d’eau qui déchirent les membranes cellulaires (dommages mécaniques).
- Surfusion : à une certaine température les cellules commencent à vibrer du fait d’un effet de surfusion car le milieu intracellulaire est plus chaud que le milieu extracellulaire, ce qui réchauffe le milieu et donc ralenti la congélation.
La cryoconservation par des congélateurs à descente en température contrôlée, ou CRF (Controled-Rate Freezer) permet de minimiser les deux effets grâce à un ajustement de la vitesse de diminution de température en fonction de la température réelle de l'échantillon, compensant ainsi la chaleur de fusion et minimisant les effets de surfusion.
Principe de la cryoconservation
La congélation des cellules doit donc se faire en présence d’un agent cryoprotecteur destiné à éviter la création des dommages intracellulaires durant le processus de congélation. Le milieu de cryoconservation comprend typiquement un milieu de culture supplémenté avec :
- Un cryoprotecteur, essentiel pour éviter le stress cellulaire pendant le processus de congélation-décongélation. Il existe plusieurs agents cryoprotecteurs tels que l’éthylène glycol, l’hydroxyethyl starsh ou le glycérol. Cependant, c’est de dimethylsulfoxide (DMSO) qui est le plus largement employé car il permet une meilleure préservation des cellules que les autres molécules.
- Une source de protéine. Il s’agit généralement du sérum de veau fœtal. Dans le cas où le sérum de veau fœtal doit être évité (par exemple afin d’éviter la présence de protéines d’origine animale, xénogéniques), il est possible de compléter le milieu de culture avec du sérum humain ou de l’albumine humaine ou avec des milieux conditionnés sans sérum.
Protocole de congélation
De nombreux protocoles de congélation existent dans la littérature avec quelques variations notamment en termes de vitesse d’addition du cryoprotecteur à la suspension cellulaire et dans la vitesse de descente en température. Nous vous présentons ici celui qui est utilisé en routine chez Lymphobank :
- Ajouter du DMSO à une solution d’albumine humaine 4% préalablement maintenue à une température de +4°C, afin d’obtenir une solution à 20% v/v de DMSO dans un tube de 15 mL ou de 50 mL. Maintenir la solution DMSO 20% / albumine humaine 4% à +4°C. Le mélange DMSO/protéine provoquant une réaction exothermique, il est important de limiter cette réaction par l’utilisation d’albumine froide et de maintenir le mélange DMSO/protéine à +4°C avant de le mettre en contact avec les cellules afin d’éviter une altération de celles-ci.
- Resuspendre les cellules dans de l’albumine humaine 4% préalablement maintenue à une température de +4°C, afin d’obtenir une suspension cellulaire deux fois concentrée, dans un tube de 15 mL ou de 50 mL.
- Ajouter goutte à goutte un volume de solution de DMSO 20%/Albumine 4% à un volume de suspension cellulaire afin que la concentration de DMSO augmente progressivement, en présence des cellules, à la concentration finale de 10%. L’opération doit être réalisée à 4°C en maintenant les tubes sur de la glace par exemple. La concentration finale à laquelle les cellules sont congelées peut varier selon le type cellulaire, mais elle se situe généralement dans un intervalle de 1x10.6 à 5x10.6 cellules/mL de milieu de congélation pour des lignées et jusqu’à 20x10.6 cellules/mL pour des cellules sanguines primaires. La congélation des cellules à une densité trop faible ou trop élevée peut avoir un impact sur la viabilité et doit être évitée.
- Répartir les cellules en cryotube (sous un volume de 1 à 4 mL, selon les cryotubes) ou en poche de congélation, maintenus à +4°C sur de la glace.
- Congeler dans un CRF selon le protocole suivant :
L’apport de vapeur d’azote liquide dans la chambre de congélation de l’appareil est insufflée en fonction de la consigne de température et des températures relevées par une sonde de température insérée dans une cryotube témoin contenant uniquement du milieu de conservation et par une sonde externe, située dans la chambre de congélation du CRF. Si vous ne disposez pas d’un CRF, une alternative consiste à congeler les cellules en mettant les cryovials dans un récipient de congélation de type Mr Frosty™ (Thermo Fisher) contenant de l’alcool isopropylique. Le récipient est alors placé dans un congélateur à -80°C durant au moins 4h, idéalement 24h, ce qui permet d’obtenir une vitesse de descente en température proche de 1°C/mn.
- Lorsque la température de l’échantillon atteint un plateau de -140°C, les cryotubes sont transférés et stockés en vapeur d’azote liquide.
Dans le cas d'une congélation avec un ''Mr Frosty'', il n’est pas conseillé de stocker les cryovials trop longtemps à -80°C car cela peut altérer la viabilité cellulaire (une durée maximale d’une semaine, voire moins pour les cellules les plus fragiles, est généralement recommandée). Cette méthode peut donner des résultats satisfaisants mais néanmoins inférieurs en termes de viabilité et de fonctionnalité qu’avec une congélation maitrisée, avec un CRF.
Protocole de décongélation
Si la congélation des cellules doit être lente et maîtrisée, la décongélation doit au contraire être la plus rapide possible afin de limiter des altérations dues à la déshydratation ainsi qu’à la toxicité du DMSO. Là encore, divers protocoles de décongélation peuvent exister et nous vous présentons ici celui que nous utilisons en routine :
- Préparer un bain-marie à 37°C
- Pour chaque cryovial, préparer environ 5 mL de milieu de décongélation (généralement du tampon PBS ou, pour les cellules plus fragiles, du milieu de culture) dans un tube de 15 mL, maintenu au bain-marie à 37°C.
- Transférer le cryovial depuis la cuve de stockage en azote liquide ou le congélateur -150°C vers le laboratoire en le maintenant congelé : il est impératif de transporter le cryovial soit dans un récipient de transport contenant de la vapeur d’azote liquide (dry-shipper) soit dans une boite contenant de la carboglace (-80°C) afin de prévenir le réchauffement du cryovial durant le temps de transport vers le laboratoire.
- Placer le cryovial dans un bain-marie à 37 ° C et décongeler sous agitation manuelle jusqu'à ce que le contenu soit partiellement décongelé : un glaçon doit persister dans le cryovial
- Sous un Poste de Sécurité Microbiologique de type II (PSM II), transférer immédiatement les cellules dans la solution de décongélation. Rincer le cryotube avec 1 mL de milieu de décongélation (afin notamment de finir la décongélation du glaçon, s’il n’a pas fondu) et regrouper avec les cellules déjà décongelées. Pour certaines cellules sensibles (cellules souches, cellules primaires), ajouter les cellules goutte à goutte dans le milieu de décongélation pour préserver la viabilité.
- Compléter le volume à 10 mL avec du milieu de décongélation
- Laver deux fois les cellules par centrifugation durant 10 mn à 450 rpm avant de les mettre en culture
Pour certaines cellules fragiles, il est préférable de les transférer directement dans un flacon de culture après décongélation, sans les laver par centrifugation, et de changer le milieu de culture le lendemain pour éliminer toute trace résiduelle de cryoprotecteur.
Avant la congélation : les points d’attention
Vérifiez l’état de vos cellules avant congélation :
- Viabilité cellulaire : elle doit être vérifiée systématiquement avant la congélation, par la numération des cellules vivantes et des cellules mortes.
- Evaluation de la non-contamination microbiologique des cellules : elle est importante, surtout dans le cas de lignées cellulaires où il faut vérifier non seulement l’absence de contamination bactérienne et fongique mais aussi l’absence de mycoplasmes, qui peuvent passer inaperçus dans la culture mais affecter la fonctionnalité des cellules.
- Passage des lignées cellulaires : elles les lignées cellulaires devraient idéalement être congelées à un faible nombre de passages, lorsque les caractéristiques cellulaires ont eu peu de temps pour se modifier et que les dérives génétiques sont encore faibles ou inexistantes. Le passage des lignées cellulaires ou le rafraîchissement du milieu de culture 1 à 2 jours avant la congélation garantira que les cellules sont saines et dans une phase active de croissance. Par exemple, les cellules adhérentes seront congelées idéalement à environ 70 à 80% de confluence lors de la récolte pour la congélation.
Maintenez les réactifs et les cellules au froid :
Il est impératif que toute les phases de préparation des cellules et du milieu de congélation soient réalisées au froid, en maintenant les tubes sur de la glace, si possible humide : un mélange glace/eau liquide permet un meilleur échange thermique avec les tubes et une température plus basse qu’uniquement sur de la glace. Les cryotubes doivent également être maintenus au froid durant toute la phase de distribution des cellules dans les cryotubes jusqu’au moment où ceux-ci sont transférés dans le CRF ou le récipient de congélation.
Pendant la congélation : les points d’attention
Maîtrisez la vitesse de descente en température
La maitrise de la vitesse de descente en température afin d’obtenir une congélation lente des cellules est essentielle. Cette maitrise ne peut être obtenue qu’avec un CRF, l’utilisation d’une boîte de congélation fournissant une vitesse de congélation de 1°C/mn étant plus approximative et ne permettant pas de contrôler le passage du point de surfusion. De plus, un CRF permet l’enregistrement de la température au sein d’un échantillon témoin dans lequel est inséré une sonde de température. Il est donc possible de vérifier que la vitesse effective de descente en température soit conforme à la courbe théorique qui a été définie.
Durant le stockage : les points d’attention
Monitorez les températures
Il est essentiel de maîtriser la température des échantillons durant tout le processus, avant, pendant et après la congélation : l’utilisation de sondes de températures dans les réfrigérateurs, les congélateurs à -80°C ou -150°C, les CRF et les cuves d’azote, avec « rapports d’alarmes » et procédures d’intervention en cas d’incident aidera à cerner les problèmes en cas de perte de viabilité après décongélation.
Stockez les cellules en phase vapeur de l'azote plutôt qu’en azote liquide
Les cellules doivent être stockées idéalement dans la phase vapeur d'azote liquide pour empêcher le liquide de pénétrer dans les tubes afin de :
- Dérisquer les contaminations croisées entre échantillons.
- Eviter la surpression à l’intérieur du cryotube lors de la décongélation : le réchauffement d’azote liquide présent dans l’ampoule peut causer un éclatement du tube avec projection d’éclats.
Formation spécifique à la manipulation et aménagement des locaux
La manipulation d’azote liquide nécessite une formation préalable du personnel et une conception des locaux dédiés à cette activité, avec :
- Détecteur du taux d’oxygène
- Alarmes sonores et visuelles en cas de chute du taux d’oxygène
- Renouvellement de l’air en cas de chute du taux d’oxyène
- Accès visuel à l’ensemble de la zone depuis l’extérieur du local
- Présence d’Equipements de Protection Individuels adaptés
Le stockage dans un congélateur à -150°C est une alternative moins contraignante au stockage en vapeur d'azote.
Dans les deux cas, des procédures de sauvegarde des échantillons doivent être envisagées en cas de fuite des containers ou de panne des congélateurs.
Après décongélation : les points d’attention
Assurez-vous que les cellules restent congelées durant leur transfert au laboratoire
Pour éviter que la viabilité cellulaire ne soit compromise :
- Ne jamais transférer les cellules cryoconservées du local de stockage au laboratoire sur de la glace ou à température ambiante.
- Toujours transporter les cryovials sur de la glace carbonique ou dans un réservoir de transport en vapeur d'azote liquide (dry-shipper), en particulier si les cellules doivent être transportées sur une distance ou un temps considérable. Un réservoir de transport en azote liquide (type Dewar) est à éviter pour des raisons de sécurité (risque de renversement).
Vérifiez l’état de vos cellules après décongélation
Une fois les cellules congelées à –150° C ou en vapeur d’azote, il peut être utile de sacrifier l'un des cryovials pour confirmer la viabilité et la non-contamination microbiologique des cellules, selon les mêmes procédures qu’avant congélation. Vérifier l’état des cellules (viabilité, granularité, adhérence, taille, morphologie, immunophénotype…), Immédiatement après la décongélation mais également dans les jours qui suivent, par exemple par:
- Inspection visuelle au microscope
- Numération
- Analyse en cytométrie en flux